急性呼吸道感染是小兒時(shí)期的常見疾病，臨 床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示95%以上的小兒急性呼吸道感 染是由病毒導(dǎo)致的，而呼吸道合胞病毒(RSV)就是 引發(fā)急性呼吸道感染的常見病毒之一。RSV感染 主要是由于眼、口、鼻等部位的黏膜接觸導(dǎo)致的， 其中嬰幼兒感染率更高。隨著病情的發(fā)展，小 兒RSV感染除了上呼吸道感染，還可能導(dǎo)致肺炎、 支氣管炎等下呼吸道感染。不同種類病原體的 呼吸道感染的治療方法不同，有效的病原體檢測 分類能為臨床的準(zhǔn)確治療提供參考依據(jù)。病毒 分離培養(yǎng)是檢測RSV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是操作繁 瑣耗時(shí)，需要10 d左右才能得到檢測結(jié)果，且檢測 費(fèi)用高，臨床應(yīng)用受限。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年1月我 院兒科收治的175例呼吸道感染患 兒作為 研究 對(duì)象，其中男103例，女72例，年齡0.3～10歲，平均 年 齡 (4.7 ±1.3)歲 ，病 程 4 d ～2 個(gè) 月 ，平 均 病 程 (1.3±0.4)個(gè)月，其中急性支氣管肺炎67例，毛細(xì) 支氣管炎71例，小兒哮喘37例。

1.2 方法

采用痰液收集器收集所有患兒的鼻 咽吸出物，存貯于儲(chǔ)液器內(nèi)，使用Hank液進(jìn)行吹 打混勻后，以1 000 r/min的速度離心5 min，吸取上 清液，并保存在－80 ℃環(huán)境下備用待檢。所有受 檢的患兒均分別采用免疫熒光技術(shù)和熒光探針 PCR技術(shù)檢測患兒RSV感染的情況，并以病毒培養(yǎng) 法進(jìn)行明確診斷。

1.2.1 免疫熒光技術(shù)檢測

吸取500 μL的鼻咽 吸出物樣本，加入5～8 mL的磷酸緩沖鹽溶液， 先置入旋渦混合器（旋渦混合器VORTEX-5）震蕩3～5 min進(jìn)行混合均勻， 再以300～500 r/min的離心速度離心10 min。去除 上清液后，收集下面的沉淀物再次加入5～8 mL 的磷酸緩沖鹽溶液并重復(fù)震蕩和離心的操作。再 次收集沉淀物后加入一定的磷酸緩沖鹽溶液調(diào)成 1.0×106 的細(xì)胞懸液。吸收25 μL的細(xì)胞懸液加入8孔載玻片中，37 ℃條件下待其干燥后使用冷丙 酮固定10 min。接著在玻片上滴加熒光抗體染色， 室溫下進(jìn)行孵育0.5 h。然后采用磷酸鹽吐溫緩沖 液連續(xù)沖洗3次玻片后再采用蒸餾水進(jìn)行沖洗，去 除多余的沖洗液，最后待玻片徹底干燥后在每個(gè) 細(xì)胞點(diǎn)上加上1滴封片劑進(jìn)行封片。在德國蔡司公 司的AXIOVERT 40型熒光顯微鏡下觀察載玻片上 細(xì)胞點(diǎn)內(nèi)的熒光情況。以出現(xiàn)熒光蘋果綠視為 PSV感染陽性，否則視為陰性。

1. 2. 2 免 疫 探 針 PCR 技 術(shù) 檢 測

吸 取 150 μL 的 鼻 咽 吸 出 物 樣 本 ，選 用 德 國 Qiagen 公 司 的 QIAmpRNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒按照其 說明書進(jìn)行提取樣本中的病毒RNA。根據(jù)探針設(shè) 計(jì)原則選擇的引物為，上游：RSV- F：5'- GGA CAA GTT G TT GAG GTT TAT GAA TAT GC- 3'，下游： RSV- R：5'- T TC TGC TGT CAA GTC TAG TACACT GTA GT- 3'。采用隨機(jī)合成的引物將提取到的RNA 合成cDNA，選用美國ABI公司的7500型熒光PCR 儀放入反應(yīng)管進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)置的反應(yīng)條 件為：①42 ℃，8 min預(yù)變性。②94 ℃，30 s，55 ℃， 30 s，72 ℃，45 s，35個(gè)循環(huán)。熒光素設(shè)定FAM，反 應(yīng)結(jié)束后通過擴(kuò)增Ct值判斷結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)免疫熒光技術(shù)和熒光探針 PCR技術(shù)進(jìn)行檢測患兒RSV感染的情況，以病毒培 養(yǎng)法的RSV感染結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，比較免 疫熒光技術(shù)和熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的靈敏度、特異度以及準(zhǔn)確性等診斷效 能。靈敏度＝真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)＋假陰性 人數(shù))×100%。特異度＝真陰性人數(shù)/ (真陰性人 數(shù)＋假陽性人數(shù)) ×100%。準(zhǔn)確性＝(真陰性人 數(shù)＋真陽性人數(shù))/(真陰性人數(shù)＋假陰性人數(shù)＋真 陽性人數(shù)＋假陽性人數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn) 行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，診斷效能等計(jì)數(shù)資料采用 率表示，組間差異采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法診斷RSV感染的結(jié)果比較

(表1) 175例呼吸道感染患兒中RSV感染陽性103例，其 中男64例，占比62.14%，女39例，占比37.86%。免 疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染陽性98例，其 中真陽性88例，熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷患兒 RSV感染陽性104例，其中真陽性102例。

2.2 兩種檢測方法診斷RSV感染的診斷效能比較

(表2) 免疫熒光技術(shù)檢測診斷患兒RSV感染的 靈 敏 度 、 特 異 度 以 及 準(zhǔn) 確 性 分 別 為 85.44% 、 86.11%、85.71%。熒光探針PCR技術(shù)檢測診斷的 靈 敏 度 、特 異 度 以 及 準(zhǔn) 確 性 分 別 為 99.03% 、 97.22%、98.29%，兩者相比熒光探針PCR技術(shù)檢 測診斷患兒RSV感染的各項(xiàng)診斷效能均優(yōu)于免 疫熒光技術(shù)檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。




3 討論

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前國內(nèi)每年死于急性呼吸道感 染的患兒約有10萬，其中在部分經(jīng)濟(jì)發(fā)展較為滯 后的省市急性呼吸道感染患兒的病死率更高，嚴(yán) 重影響兒童的身體健康和生命安全。根據(jù)感染病原體的不同，主要分為細(xì)菌感染和病毒感染，以 后者的占比更大，高達(dá)90%。其中RSV是導(dǎo)致兒童 急性呼吸道感染的常見病原體，也是目前全球范 圍內(nèi)公認(rèn)的誘發(fā)兒童急性肺炎和毛細(xì)支氣管炎的 最為主要的病原體。在發(fā)生RSV呼吸道感染時(shí)，缺乏特異性的臨床癥狀及表現(xiàn)，依靠其進(jìn)行鑒別 診斷的難度較高。



 

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