缺血性腦卒中最有效的治療方法是恢復(fù)梗死區(qū) 血流灌注，但由此引發(fā)的再灌注損傷問題也凸顯出 來。腦缺血再灌注損傷是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，神 經(jīng)元凋亡在其損傷過程中起著重要作用，是損傷所致 一系列有害生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

60 只體質(zhì)量 220～240 g 的 SPF 級(jí) 3 月齡雄性 SD 大鼠（三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)： SCXK（鄂）2012-0068），按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手 術(shù)組、缺血/再灌注組和電針預(yù)處理組，每組 20 只。飼 養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫 20~25 ℃， 光照時(shí)間（7：00-19：00）。本實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的 處置嚴(yán)格按照科技部398 號(hào)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》文件要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：p53 抗體、caspase-3 抗體（批號(hào)分 別為 sc-71820、sc-271759，Santa 公司）；TUNEL 試劑盒（批號(hào)為 11684817910，Roche 公司）；TTC 染色液（批號(hào)為 A610558-0025，Sangon Biotech 公 司）；DAB 顯色劑（K5007，DAKO 公司）。 主要儀器：3400 線栓（廣州佳靈）；RM2016病理切片機(jī) （上海徠卡儀器有限公司 ） ； Nikon Eclipse Ti-SR 倒置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3 成像系 統(tǒng)（日本尼康）；HANS-200 電針治療儀（北京華運(yùn) 安特科技有限責(zé)任公司）；華佗牌毫針（0.25 mm× 13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠）。

1.3 模型制備

缺血/再灌注組和電針預(yù)處理組，參照 Longa 等造模方法，建立大鼠右側(cè)局灶性腦缺血再灌注損傷模 型。大鼠禁食 12 h，仰臥位固定，2%戊巴比妥鈉溶液 （3 mL/kg）腹腔注射麻醉，消毒后沿頸部正中剪一 切口，長(zhǎng)約 2 cm，向右縱行逐層鈍性分離肌肉及筋膜， 在頸前肌群近前斜角肌端處游離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA） 及其分支頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA），術(shù)中 注意保護(hù)迷走神經(jīng)。

1.4 干預(yù)方法

電針預(yù)處理組造模前先進(jìn)行電針干預(yù)，參照華 興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》取穴，“百 會(huì)”位于大鼠頂骨正中，“腎俞”位于第 2 腰椎下兩 旁，“三陰交”位于后肢內(nèi)踝尖直上 10 mm，其中 “百會(huì)”經(jīng)皮沿腦正中線向額斜刺約 2 mm，“腎 俞”直刺約 6 mm，“三陰交”直刺 4~5 mm。同側(cè)“腎 俞”和“三陰交”接成一對(duì)電極，“百會(huì)”與其旁 開 1 cm 處提捏皮膚淺刺 1 mm 的輔助電極接成一對(duì) 電極，接 HANS-200 電針治療儀，予疏密波，頻率 2 Hz/100 Hz，強(qiáng)度 1 mA，通電 10 min，留針不通電 5 min，連續(xù)重復(fù) 4 次，共計(jì) 1 h。電針干預(yù)結(jié)束后 觀察 30 min 行造模手術(shù)。此過 程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后 將玻片置于 PBS（pH=7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3 次，每次 5 min。3% H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物 酶，加兔抗 p53 抗體、兔抗 caspase-3 抗體（1∶ 200）孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，顯微鏡下 控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，流水沖洗切片終止 顯色，脫水封片。每組 10 個(gè)樣本，每個(gè)樣本切片在 海馬 CA3 區(qū)隨機(jī)挑選 3 個(gè) 200 倍視野進(jìn)行拍照，應(yīng) 用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出 陽性區(qū)域的累積吸光度，取其均數(shù)為該樣本的 IOD 值，IOD 值越大，陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

假手術(shù)組無神經(jīng)功能喪失；缺血/再灌注組神經(jīng) 行為學(xué)改變明顯，大鼠左前肢明顯不能充分伸展， 或向左環(huán)行運(yùn)動(dòng)，出現(xiàn)輕度局灶神經(jīng)功能喪失，或 向左側(cè)倒，出現(xiàn)中度局灶神經(jīng)功能喪失；電針預(yù)處 理組神經(jīng)行為學(xué)癥狀較缺血/再灌注組明顯減輕。 缺血/再灌注組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組 （P＜0.01）；缺血/再灌注組和電針預(yù)處理組神經(jīng) 行為學(xué)評(píng)分分別為 2.95±0.22 和 1.75±0.64，電針 預(yù)處理組明顯低于缺血/再灌注組（P＜0.01）。見 圖 1。

假手術(shù)組大鼠右側(cè)未見腦梗死灶，缺血/再灌注 組大鼠右側(cè)腦梗死灶明顯，兩組間腦梗死百分比比 較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與缺血/再灌注 組比較，電針預(yù)處理組大鼠右側(cè)梗死面積明顯減小 （P＜0.01）。見圖 2。缺血/再灌注組右側(cè)海馬 CA3 區(qū) p53 陽性表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；與缺血/ 再灌注組比較，電針預(yù)處理組右側(cè)海馬 CA3 區(qū) p53 陽性表達(dá)量明顯減少（P＜0.01）。caspase-3 為細(xì)胞 質(zhì)著色，陽性細(xì)胞呈棕黃色，其中假手術(shù)組大鼠右側(cè) 海馬 CA3 區(qū)僅有極少量神經(jīng)元胞質(zhì)黃染，缺血/再灌 注組右側(cè)海馬 CA3 區(qū)大量神經(jīng)元胞質(zhì)黃染，caspase-3 的陽性表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；與缺血/再灌注組 比較，電針預(yù)處理組右側(cè)海馬 CA3 區(qū) caspase-3 的 陽性表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，包括 炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、興奮性毒性等， 這些因素彼此關(guān)聯(lián)，相互重疊，最終導(dǎo)致缺血區(qū)細(xì) 胞損傷、凋亡甚至壞死，進(jìn)而引起腦功能障礙 。 研究表明，神經(jīng)元凋亡是腦缺血再灌注損傷所致 一系列有害生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)（這些反應(yīng)包括鈣穩(wěn)態(tài)失 衡所致興奮性中毒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能受損，自 由基氧化應(yīng)激引發(fā) DNA 損害，促凋亡基因表達(dá)的上 調(diào)，效應(yīng)半胱氨酸蛋白酶的激活，核酸內(nèi)切酶降解 基因組等）的結(jié)果，是腦缺血再灌注損傷的重要發(fā) 生機(jī)制之一。



 

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