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脫色搖床對(duì)灌注損傷大鼠海馬神經(jīng)元的使用

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-09-16 09:30【

缺血性腦卒中最有效的治療方法是恢復(fù)梗死區(qū) 血流灌注,但由此引發(fā)的再灌注損傷問題也凸顯出 來。腦缺血再灌注損傷是一個(gè)十分復(fù)雜的過程,神 經(jīng)元凋亡在其損傷過程中起著重要作用,是損傷所致 一系列有害生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

60 只體質(zhì)量 220~240 g 的 SPF 級(jí) 3 月齡雄性 SD 大鼠(三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào): SCXK(鄂)2012-0068),按照隨機(jī)數(shù)字表分為假手 術(shù)組、缺血/再灌注組和電針預(yù)處理組,每組 20 只。飼 養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫 20~25 ℃, 光照時(shí)間(7:00-19:00)。本實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的 處置嚴(yán)格按照科技部398 號(hào)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》文件要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑:p53 抗體、caspase-3 抗體(批號(hào)分 別為 sc-71820、sc-271759,Santa 公司);TUNEL 試劑盒(批號(hào)為 11684817910,Roche 公司);TTC 染色液(批號(hào)為 A610558-0025,Sangon Biotech 公 司);DAB 顯色劑(K5007,DAKO 公司)。 主要儀器:3400 線栓(廣州佳靈);RM2016病理切片機(jī) (上海徠卡儀器有限公司 ) ; Nikon Eclipse Ti-SR 倒置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3 成像系 統(tǒng)(日本尼康);HANS-200 電針治療儀(北京華運(yùn) 安特科技有限責(zé)任公司);華佗牌毫針(0.25 mm× 13 mm,蘇州醫(yī)療用品廠)。

1.3 模型制備

缺血/再灌注組和電針預(yù)處理組,參照 Longa 等造模方法,建立大鼠右側(cè)局灶性腦缺血再灌注損傷模 型。大鼠禁食 12 h,仰臥位固定,2%戊巴比妥鈉溶液 (3 mL/kg)腹腔注射麻醉,消毒后沿頸部正中剪一 切口,長(zhǎng)約 2 cm,向右縱行逐層鈍性分離肌肉及筋膜, 在頸前肌群近前斜角肌端處游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA) 及其分支頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA),術(shù)中 注意保護(hù)迷走神經(jīng)。

1.4 干預(yù)方法

電針預(yù)處理組造模前先進(jìn)行電針干預(yù),參照華 興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》取穴,“百 會(huì)”位于大鼠頂骨正中,“腎俞”位于第 2 腰椎下兩 旁,“三陰交”位于后肢內(nèi)踝尖直上 10 mm,其中 “百會(huì)”經(jīng)皮沿腦正中線向額斜刺約 2 mm,“腎 俞”直刺約 6 mm,“三陰交”直刺 4~5 mm。同側(cè)“腎 俞”和“三陰交”接成一對(duì)電極,“百會(huì)”與其旁 開 1 cm 處提捏皮膚淺刺 1 mm 的輔助電極接成一對(duì) 電極,接 HANS-200 電針治療儀,予疏密波,頻率 2 Hz/100 Hz,強(qiáng)度 1 mA,通電 10 min,留針不通電 5 min,連續(xù)重復(fù) 4 次,共計(jì) 1 h。電針干預(yù)結(jié)束后 觀察 30 min 行造模手術(shù)。
此過 程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后 將玻片置于 PBS(pH=7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3 次,每次 5 min。3% H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物 酶,加兔抗 p53 抗體、兔抗 caspase-3 抗體(1∶ 200)孵育過夜,滴加二抗,DAB 顯色,顯微鏡下 控制顯色時(shí)間,陽性為棕黃色,流水沖洗切片終止 顯色,脫水封片。每組 10 個(gè)樣本,每個(gè)樣本切片在 海馬 CA3 區(qū)隨機(jī)挑選 3 個(gè) 200 倍視野進(jìn)行拍照,應(yīng) 用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出 陽性區(qū)域的累積吸光度,取其均數(shù)為該樣本的 IOD 值,IOD 值越大,陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

假手術(shù)組無神經(jīng)功能喪失;缺血/再灌注組神經(jīng) 行為學(xué)改變明顯,大鼠左前肢明顯不能充分伸展, 或向左環(huán)行運(yùn)動(dòng),出現(xiàn)輕度局灶神經(jīng)功能喪失,或 向左側(cè)倒,出現(xiàn)中度局灶神經(jīng)功能喪失;電針預(yù)處 理組神經(jīng)行為學(xué)癥狀較缺血/再灌注組明顯減輕。 缺血/再灌注組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組 (P<0.01);缺血/再灌注組和電針預(yù)處理組神經(jīng) 行為學(xué)評(píng)分分別為 2.95±0.22 和 1.75±0.64,電針 預(yù)處理組明顯低于缺血/再灌注組(P<0.01)。見 圖 1。

假手術(shù)組大鼠右側(cè)未見腦梗死灶,缺血/再灌注 組大鼠右側(cè)腦梗死灶明顯,兩組間腦梗死百分比比 較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與缺血/再灌注 組比較,電針預(yù)處理組大鼠右側(cè)梗死面積明顯減小 (P<0.01)。見圖 2。缺血/再灌注組右側(cè)海馬 CA3 區(qū) p53 陽性表達(dá)明顯增多(P<0.01);與缺血/ 再灌注組比較,電針預(yù)處理組右側(cè)海馬 CA3 區(qū) p53 陽性表達(dá)量明顯減少(P<0.01)。caspase-3 為細(xì)胞 質(zhì)著色,陽性細(xì)胞呈棕黃色,其中假手術(shù)組大鼠右側(cè) 海馬 CA3 區(qū)僅有極少量神經(jīng)元胞質(zhì)黃染,缺血/再灌 注組右側(cè)海馬 CA3 區(qū)大量神經(jīng)元胞質(zhì)黃染,caspase-3 的陽性表達(dá)明顯增多(P<0.01);與缺血/再灌注組 比較,電針預(yù)處理組右側(cè)海馬 CA3 區(qū) caspase-3 的 陽性表達(dá)明顯減少(P<0.01)。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,包括 炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、興奮性毒性等, 這些因素彼此關(guān)聯(lián),相互重疊,最終導(dǎo)致缺血區(qū)細(xì) 胞損傷、凋亡甚至壞死,進(jìn)而引起腦功能障礙 。 研究表明,神經(jīng)元凋亡是腦缺血再灌注損傷所致 一系列有害生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)(這些反應(yīng)包括鈣穩(wěn)態(tài)失 衡所致興奮性中毒,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能受損,自 由基氧化應(yīng)激引發(fā) DNA 損害,促凋亡基因表達(dá)的上 調(diào),效應(yīng)半胱氨酸蛋白酶的激活,核酸內(nèi)切酶降解 基因組等)的結(jié)果,是腦缺血再灌注損傷的重要發(fā) 生機(jī)制之一。




 


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